Современное развитие медицинских технологий способствует разработке все новых подходов к лечению бесплодия. Так, широкое применение в клинической практике получил один из методов репродуктивных вспомогательных технологий — криоконсервация сперматозоидов, эмбрионов, ооцитов. В этой статье мы рассмотрим новый современный вид подготовки к оплодотворению эмбрионов или сперматозоидов с помощью глубокой заморозки жидким азотом.
Этот метод в определенной степени способствует решению проблемы сохранения и дальнейшего использования биологического материала, который остается неиспользованным во время проведения циклов оплодотворения in vitro. Ведь при низких температурах эмбрионы хранятся в жизнеспособном состоянии, не нарушается их метаболическая активность, а эффективность использования, то есть уровень имплантации, не уступает программам оплодотворения in vitro с использованием свежих образцов биоматериала.
В мировой медицинской практике накоплен значительный опыт достижения беременности путем размораживания и оплодотворения зрелых ооцитов. До недавнего времени как криопротектор использовали реагент диметилсульфоксид (DMSO) и схему медленного охлаждения и быстрого оттаивания. Впоследствии стали применять пропандиол (PROH), а затем — комбинацию пропандиола и сахарозы, которая превратилась в первый коммерческий набор средств для замораживания и оттаивания ооцитов.
Проблемы замораживания клеток
Вместе с тем, технология замораживания клеток все еще недостаточно отработана, а потому ее совершенствование остается актуальной проблемой, требующей дальнейшего решения. Трудности криоконсервации зрелой яйцеклетки связаны:
- со значительным объемом ее цитоплазмы;
- высоким содержанием воды в клетке;
- состоянием хромосом, находящихся в метафазе мейоза и очень чувствительных к температурным и осмотических колебаний при замораживании, и (что очень важно) оттаивании.
Основной причиной повреждения клеток при замораживании и оттаивании является процесс образования кристаллов льда внутри клетки. Казалось бы, что обезвоживание клетки может решить эту проблему, но удаление слишком большого объема воды также считается разрушительным для клетки.
Известно, что температура замерзания воды, в которой содержатся различные ионы, ниже 0°С и зависит от их концентрации. При криоконсервации клетки часть молекул воды подвергается кристаллизации, которая повышает концентрацию и тем самым снижает температуру замораживания.
Рост в клетке уровня осмотического давления также имеет разрушительное действие. На сегодняшний день однозначно доказано, что фактором повреждения клеток является не низкая температура, а кристаллы льда, образующиеся в определенных температурных зонах при замораживании и оттаивании.
Как происходит процесс замораживания клеток с помощью криотехнологий?
Процесс глубокой заморозки материала происходит в основном двумя способами:
- Методом медленной криоконсервации.
- Методом несбалансированной криоконсервации, которая состоит из ультрабыстрой криоконсервации и витрификации.
Метод медленной криоконсервации, осуществляемый поэтапно, наиболее распространенный способ замораживания человеческих эмбрионов. При медленном пошаговом охлаждении происходит дегидратация клеток, что способствует уменьшению риска образования внутриклеточных больших кристаллов льда.
Благодаря наличию осмотического градиента криопротекторы «вытягивают» из клетки воду, которая в межклеточном пространстве замерзает. С целью предотвращения спонтанного образования льда применяют ручной сидинг (seeding). Пинцетом прикасаются к соломинкам, которые содержат раствор с клетками при температуре -6,5°С, с последующей десятиминутной экспозицией при температуре кристаллизации.
Поэтому при температуре -35°С эмбрионы помещают в жидкий азот, где проходит заключительная стадия замораживания и где эмбрионы могут сохраняться до использования.
Однако риск повреждения эмбрионов вследствие меж- и внутриклеточной кристаллизации остается достаточно большим. Кроме того, метод медленной криоконсервации осуществляется с помощью специальной аппаратуры, стоимость которой высока.
Методы заморозки эмбрионов для подготовки к ЭКО
Метод ультрабыстрой криоконсервации заключается в следующем. Эмбрионы, которые находились в растворе диметилсульфоксида и сахарозы, переносят в жидкий азот, мелкие кристаллы льда, образующиеся впоследствии, тают при более низких температурах.
Метод витрификации (от лат. vitrum — стекло) заключается в преобразовании жидкости до твердого состояния в результате процесса экстремального повышения вязкости клетки при охлаждении, а не кристаллизации, т.е. витрификация — это замораживание без образования кристаллов льда. При витрификации не только процесс охлаждения значительно упрощается, но и исчезает опасность химических и физических повреждений, вызванных меж- и внутриклеточной кристаллизацией.
Этот метод осуществляется с помощью витрификационной жидкости, которая состоит из двух видов криопротекторов:
- раствора с высокой концентрацией криопротектора, способного проникать сквозь мембрану клетки (пропиленглюколь, глицерин, этиленгликоль);
- раствора малопроникающего криопротектора для обеспечения дегидратации клеток (полиэтиленглюколь, фикол, сахароза).
Концентрация криопротектора настолько высокая, что при слишком быстром охлаждении до -196°С вязкость жидкости сильно возрастает.
Важно, что для витрификации, в отличие от медленной криоконсервации, применяют одни и те же растворы, независимо от стадии развития ооцитов или эмбрионов. Практически процесс витрификации заключается в размещении ооцитов или эмбрионов в витрификационной среде, но на очень короткое время с целью предотвращения токсического воздействия вследствие дальнейшего сверхбыстрого замораживания.
Таким образом, метод витрификации не требует значительных материально-технических затрат, и является удобным для практического применения. При витрификации значительно упрощается процесс охлаждения, что предотвращает развитие физических и химических повреждений клеток вследствие образования меж- и внутриклеточных кристаллов.
Как заключение, хотим сказать, что витрификацию в программах экстракорпорального оплодотворения можно рассматривать как альтернативу протокола медленного замораживания. Надеемся, что в ближайшем будущем будет однозначно доказано преимущество витрификации над медленным замораживанием.
